Khi mới ra trường và mới vào nghề, bạn phải đối mặt với một đống danh từ đối mặt với thí nghiệm real-time PCR định lượng. Bạn bối rối không biết bắt đầu từ đâu? Ý nghĩa của đường cong khuếch đại, đường cong chuẩn, ngưỡng, giá trị CT, đường cong nóng chảy và đường cơ sở là gì? Hình ảnh huỳnh quang từ những thí nghiệm đó quá sáng, nhưng dường như tôi không thể xác định được chúng. Hôm nay, chúng tôi sẽ đưa các bạn tìm hiểu những kiến thức và khái niệm này qua hai phần: thuật ngữ kỹ thuật và câu hỏi thường gặp.
Phần I Thuật ngữ chuyên môn
1. Đường cong khuếch đại
Đường cong khuếch đại đề cập đến đường cong trong đó số chu kỳ là trục hoành và cường độ huỳnh quang thời gian thực trong phản ứng là tọa độ trong PCR.
2. Đường cơ sở
Đường cơ sở đề cập đến sự thay đổi nhỏ trong tín hiệu huỳnh quang trong vài chu kỳ đầu tiên của phản ứng khuếch đại PCR. Mức tín hiệu hiển thị gần với một đường thẳng, đó là đường cơ sở.
3. Cài đặt ngưỡng huỳnh quang
Thông thường, tín hiệu huỳnh quang của 15 chu kỳ đầu tiên của phản ứng PCR được sử dụng làm tín hiệu nền huỳnh quang và ngưỡng huỳnh quang gấp 10 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu huỳnh quang trong 3-15 chu kỳ PCR và ngưỡng huỳnh quang được thiết lập trong giai đoạn khuếch đại PCR theo cấp số nhân. Thông thường, mỗi thiết bị đều có ngưỡng huỳnh quang trước khi sử dụng.
4. Giá trị CT
Giá trị CT biểu thị số chu kỳ sẽ xảy ra đối với mỗi ống phản ứng PCR khi tín hiệu huỳnh quang đạt đến ngưỡng đã đặt. Từ nghiên cứu, chúng tôi biết rằng có một mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị CT của từng mẫu và logarit của số lượng bản sao bắt đầu của mẫu đó. Số bản sao ban đầu càng cao thì giá trị CT càng nhỏ và ngược lại. Sử dụng các tiêu chuẩn với số bản sao bắt đầu đã biết, một đường cong hiệu chuẩn có thể được thực hiện trong đó trục hoành biểu thị logarit của số bản sao bắt đầu, trong khi tọa độ biểu thị giá trị CT. Do đó, miễn là thu được giá trị CT của mẫu chưa biết, số lượng bản sao ban đầu của mẫu có thể được tính từ đường cong chuẩn.
biêt nhiêu hơn
Có một số chỉ số để đánh giá xem đường cong khuếch đại có tốt hay không:
Trả lời: Điểm uốn của đường cong là rõ ràng, đặc biệt là giai đoạn hàm mũ của mẫu tỷ lệ nặng thấp là rõ ràng, tính song song tổng thể của đường cong khuếch đại rất tốt, đường cơ sở bằng phẳng, không có hiện tượng tăng và khuếch đại đường cong của mẫu nồng độ pha hàm mũ cấp thấp là rất tốt. rõ ràng.
B: Độ dốc của pha hàm mũ của đường cong tỷ lệ thuận với hiệu suất khuếch đại, độ dốc càng lớn thì hiệu suất khuếch đại càng cao.
C: Đường cơ sở tiêu chuẩn bằng phẳng hoặc giảm nhẹ, không có xu hướng tăng rõ ràng.
D: Độ song song của các đường cong khuếch đại cho mỗi ống là tốt, cho thấy hiệu suất khuếch đại của mỗi ống phản ứng là tương tự nhau.
5. Đường cong nóng chảy
Khi sản phẩm PCR được gia nhiệt, khi nhiệt độ tăng lên, sản phẩm khuếch đại sợi đôi dần dần phân ly, dẫn đến cường độ huỳnh quang giảm. Khi đạt đến một nhiệt độ nhất định, một lượng lớn sản phẩm sẽ tách ra khiến huỳnh quang giảm mạnh. Sử dụng chức năng này cùng với các giá trị TM khác nhau cho các sản phẩm PCR khác nhau cũng khác nhau về nhiệt độ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang giảm nhanh chóng, đây có thể là một cách tốt để xác định tính đặc hiệu của PCR.
6. Đường cong nóng chảy (sử dụng đường cong logarit)
Biểu đồ đỉnh được hình thành bởi logarit của đường cong nóng chảy để hiển thị trực quan hơn tình trạng của các mảnh sản phẩm. Vì nhiệt độ nóng chảy là giá trị TM của đoạn DNA, nên có thể xác định một số tham số nhất định ảnh hưởng đến giá trị TM của đoạn DNA, chẳng hạn như kích thước đoạn, hàm lượng GC, v.v. Nói chung, theo nguyên tắc thiết kế mồi của chúng tôi, người ta thường nói rằng chiều dài của sản phẩm được khuếch đại nằm trong khoảng 80-300bp và nhiệt độ nóng chảy phải nằm trong khoảng từ 80 độ đến 90 độ .
Trả lời: Nếu chỉ có một đỉnh chính trong khoảng từ 80 độ đến 90 độ, điều đó có nghĩa là PCR thời gian thực là hoàn hảo.
B: Nếu đỉnh chính xuất hiện trong khoảng từ 80 độ đến 90 độ và đỉnh tạp chất xuất hiện dưới 80 độ, thì về cơ bản mồi-dimer được coi là. Đây là một lựa chọn tốt để cố gắng giải quyết bằng cách tăng nhiệt độ ủ.
C: Nếu đỉnh chính xuất hiện trong khoảng từ 80 độ đến 90 độ và một đỉnh lang thang xuất hiện khi nhiệt độ tăng, thì về cơ bản DNA đã bị nhiễm bẩn. Và DNA cần phải được loại bỏ trong giai đoạn đầu của thí nghiệm.
7. Đường cong chuẩn
Các chất chuẩn chuẩn được pha loãng theo các nồng độ khác nhau và được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR. Đường cong tiêu chuẩn được vẽ với logarit của số bản sao tiêu chuẩn là trục hoành và giá trị CT đo được là tọa độ. Khi định lượng một mẫu chưa biết, số lượng bản sao của mẫu có thể được lấy từ đường chuẩn dựa trên giá trị CT của mẫu chưa biết. Các đường cong tiêu chuẩn rất quan trọng để định lượng tuyệt đối.
phần thứ hai. vấn đề thường gặp
Câu hỏi 1: Sự khác biệt giữa RT-PCR, QPCR, PCR thời gian thực và RT-PCR thời gian thực là gì?
Câu trả lời 1: RT-PCR là PCR phiên mã ngược, đây là một biến thể được sử dụng rộng rãi của phản ứng chuỗi polymerase. Trong RT-PCR, chuỗi RNA được phiên mã ngược thành DNA bổ sung, sau đó được sử dụng làm khuôn cho PCR để khuếch đại DNA bằng PCR.
Real-time PCR và QPCR giống nhau, cả hai đều là PCR định lượng thời gian thực, có nghĩa là có ghi dữ liệu theo thời gian thực ở mỗi chu kỳ trong quá trình PCR. Bằng cách này, số lượng mẫu khởi động có thể được phân tích chính xác.
Mặc dù cả PCR thời gian thực và PCR phiên mã ngược dường như được viết tắt là RT-PCR, quy ước quốc tế là RT-PCR đề cập cụ thể đến PCR phiên mã ngược, trong khi PCR thời gian thực thường được viết tắt là qPCR (Định lượng Real- True Real-True Real PCR ) - PCR thời gian).
Real-time RT-PCR (RT-QPCR) là một loại PCR phiên mã ngược kết hợp kỹ thuật định lượng huỳnh quang: đầu tiên phiên mã ngược từ RNA để thu được cDNA (RT), tiếp theo là phân tích định lượng bằng real-time PCR (QPCR).
Câu hỏi 2: Tại sao độ dài của đoạn sản phẩm được khuếch đại của PCR định lượng huỳnh quang được kiểm soát trong phạm vi 80-300bp?
A2: Độ dài của mỗi trình tự gen là khác nhau, có đoạn là vài Kb, có đoạn là hàng trăm BP. Tuy nhiên, khi thiết kế đoạn mồi, chúng ta chỉ cần yêu cầu độ dài của sản phẩm là 80-300bp, quá ngắn hoặc quá dài đều không phù hợp để PCR định lượng phát hiện.
Các đoạn sản phẩm quá ngắn để có thể phân biệt được với các đoạn mồi-làm mờ. Độ dài của primer-dimer khoảng 30-40bp, khi nhỏ hơn 80bp, rất khó phân biệt đó là primer-dimer hay sản phẩm. Nếu đoạn sản phẩm quá dài, vượt quá 300bp sẽ dễ dẫn đến hiệu suất khuếch đại thấp, lượng gen không được phát hiện hiệu quả.
Ví dụ, khi bạn đếm số người trong một lớp học, bạn chỉ cần đếm xem có bao nhiêu cái miệng. Điều này cũng đúng khi xét nghiệm gen. Bạn chỉ cần phát hiện một trình tự nhất định của gen để đại diện cho toàn bộ trình tự. Nếu đếm cả miệng và mũi, tai, kính để đếm người thì rất dễ mắc sai lầm.
Q3: Độ dài tối ưu cho thiết kế sơn lót là bao nhiêu?
Câu trả lời 3: Nói chung, độ dài đoạn mồi trong khoảng 20-24bp là tốt. Tất nhiên, chúng ta phải chú ý đến giá trị TM của mồi khi thiết kế mồi, vì nó liên quan đến nhiệt độ ủ tối ưu. Sau rất nhiều thử nghiệm, người ta đã chứng minh rằng 60 độ là một giá trị TM tốt. Nhiệt độ ủ thấp dễ dẫn đến khuếch đại không đặc hiệu, trong khi nhiệt độ ủ cao thường dẫn đến hiệu suất khuếch đại thấp, đường cong khuếch đại cực đại muộn và giá trị CT bị trễ.
Câu 4: Lượng mẫu thu vào có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
Câu trả lời 4: Không. Rõ ràng, càng nhiều mẫu được thu thập, thì càng có nhiều RNA được chiết xuất, càng nhiều cDNA và sẽ có càng nhiều đoạn mục tiêu. Để định lượng tuyệt đối, cần tính số lượng bản sao của đoạn mục tiêu và lượng mẫu được thu thập chắc chắn sẽ ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Ví dụ, phát hiện virus viêm gan C HBV trong máu là phát hiện hàm lượng HBV trong một lượng nhất định (1ml) máu.
Đối với định lượng tương đối thường được sử dụng trong nghiên cứu khoa học, số lượng mẫu không liên quan gì đến kết quả thí nghiệm, bởi vì định lượng tương đối đề cập đến sự so sánh giữa gen mục tiêu và gen tham chiếu. Chỉ cần vui lòng coi chúng là các đoạn ngược dòng và xuôi dòng có trong cùng một chuỗi axit nucleic. Nếu cỡ mẫu lớn, cả gen tham chiếu và gen đích đều được tăng lên theo tỷ lệ bằng nhau cùng một lúc, điều này không ảnh hưởng đến kết quả.
Câu hỏi 5: Hiệu quả của enzyme phiên mã ngược có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
A5: Tương tự như trên. Lưu ý rằng chúng tôi muốn hiệu quả RT cao hơn, nhưng chúng tôi muốn enzyme RT tương đối ổn định và thu được kết quả đồng nhất. Đây sẽ là phép thử khả năng tối ưu của các bộ sao chép ngược của các hãng lớn.
Câu 6: Hiệu suất của enzym TAQ có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
A6: Hiệu quả của enzyme TAQ tương đối lớn. Thông thường, các enzyme taq khởi động nóng được yêu cầu và tương đối hiệu quả. Đối với các bộ định lượng huỳnh quang thương mại, mỗi nhà sản xuất sẽ tối ưu hóa hiệu quả ở trạng thái tốt nhất theo sản phẩm của chính họ gần 100%, nếu hiệu suất quá thấp thì không thể thu được kết quả thí nghiệm. Đối với các sản phẩm của các công ty khác nhau, đây là thước đo chất lượng.
Câu 7: Lượng thuốc nhuộm huỳnh quang có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
A7: Có, nó sẽ. Nếu chất huỳnh quang quá bão hòa, nó có thể gây nhiễu âm ở một số nhạc cụ. Nếu fluorochrom không bão hòa và giá trị huỳnh quang quá thấp, nó sẽ sớm bước vào giai đoạn ổn định và đường cong khuếch đại sẽ bằng phẳng. Trong thí nghiệm định lượng huỳnh quang, giá trị CT chủ yếu được nhìn thấy, do đó, đường cong khuếch đại muộn không quan trọng khi bước vào giai đoạn cao nguyên, nhưng hình ảnh không đủ đẹp. Nếu bạn phải chọn, hãy bắt đầu bằng cách chọn chất phát quang ít bão hòa hơn một chút. Tuy nhiên, khi sử dụng cùng một sản phẩm của cùng một công ty, tác dụng của nó về cơ bản là không đáng kể.
Câu 8: Việc truyền ống PCR có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
A8: Vâng. Tuy nhiên, đối với cùng một lô vật tư tiêu hao từ cùng một nhà sản xuất, ảnh hưởng này có thể được bỏ qua. Đây là một lựa chọn tốt và tốt nhất là sử dụng tấm giếng 96-với màng có độ thẩm thấu cao để giảm thiểu tác động truyền ánh sáng của vật tư tiêu hao.
Q9: Lỗi trong quá trình vận hành có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
A9: Ảnh hưởng của quá trình vận hành chủ yếu thể hiện ở tính đồng nhất. Tính đồng nhất có nghĩa là tất cả các thành phần trong hệ thống được trộn đều với nhau và ly tâm nhanh có thể giải quyết vấn đề này. Ngoài ra, đối với người mới bắt đầu, tốt nhất nên điều chỉnh hệ thống PCR lớn hơn 20 inch và hệ thống quá nhỏ sẽ dễ bị lỗi hơn. Nếu nhiệt độ ủ được tối ưu hóa chính xác, ảnh hưởng của nồng độ mồi lên CT sẽ được giảm thiểu. Và bạn sẽ biết rằng có thể tránh được một số lỗi vận hành (chẳng hạn như nồng độ mồi) bằng cách tối ưu hóa nhiệt độ ủ.
tóm tắt
Trên đây là một số câu hỏi và thắc mắc mà người mới thường gặp phải trong quá trình thử nghiệm, chúng tôi hy vọng những câu hỏi này có thể giúp bạn giải quyết một số nhầm lẫn. Thử nghiệm là quá trình tạo ra sự hỗn loạn và giải quyết vấn đề, hy vọng bạn sẽ thu được điều gì đó từ nó. Cảm ơn đã đọc và chúng tôi sẽ gặp lại bạn lần sau!