Trong thời kỳ hậu dịch bệnh, thuật ngữ "xét nghiệm axit nucleic" đã quen thuộc với tất cả chúng ta và nó đã trở thành một phần trong cuộc sống hàng ngày của chúng ta.
Vì vậy, bạn có biết làm thế nào xét nghiệm axit nucleic phát hiện virus? Và làm thế nào để thử nghiệm axit nucleic làm cho virus vô hình "có thể nhìn thấy"?
01 Axit nuclêic là gì
Axit nucleic là thuật ngữ chung cho DNA và RNA.
Axit nucleic là một thành phần thiết yếu của tất cả sự sống được biết đến trên trái đất. DNA mà chúng ta thường nói là axit deoxyribonucleic. Vật liệu di truyền của coronavirus mới là RNA - axit ribonucleic.
Thử nghiệm khuếch đại axit nucleic
02 Xét nghiệm axit nucleic chính xác phát hiện điều gì?
Chất để phát hiện axit nucleic là axit nucleic của virus.
Vi-rút corona mới là một loại vi-rút chỉ chứa RNA và trình tự RNA cụ thể trong vi-rút là dấu hiệu phân biệt vi-rút với các mầm bệnh khác. Phát hiện axit nucleic là tìm xem có axit nucleic của vi rút ngoại lai xâm nhập trong mẫu bệnh phẩm hô hấp hoặc máu của bệnh nhân hay không để xác định xem anh ta có bị nhiễm vi rút corona mới hay không. Phần lớn việc phát hiện axit nucleic hiện tại của coronavirus mới sử dụng phương pháp PCR định lượng huỳnh quang để khuếch đại trình tự đích của RNA virus bằng PCR sau khi phiên mã ngược.
PCR, hay phản ứng chuỗi polymerase, là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA cụ thể; nó đề cập đến phản ứng xúc tác DNA polymerase của các gen cụ thể hoặc Phản ứng khuếch đại nhanh trình tự DNA trong ống nghiệm còn được gọi là khuếch đại gen trong ống nghiệm. Công nghệ PCR định lượng huỳnh quang là thêm một hệ thống báo cáo huỳnh quang vào hệ thống phản ứng PCR và sử dụng sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang để theo dõi quá trình PCR trong thời gian thực, để nhận ra sự phát hiện định lượng của mẫu ban đầu.
Để phát hiện axit nucleic, bước đầu tiên là thu thập một mẫu. Hiện nay, phương pháp lấy mẫu thông thường nhất là: dùng tăm bông ngoáy họng hoặc ngoáy mũi để lau và lấy mẫu đường hô hấp trên (hầu họng hoặc khoang mũi); các mẫu được thu thập sẽ được niêm phong nghiêm ngặt, sau đó được gửi đến phòng thí nghiệm để thử nghiệm dần dần.
1. Ly trích RNA virus
Đầu tiên, RNA của virus được chiết xuất từ mẫu. Thêm thuốc thử chiết axit nucleic vào mẫu để tiêu diệt vi rút và giải phóng axit nucleic.
2. “Sao chép ngược” RNA virus thành cDNA
Thông qua công nghệ sao chép ngược (RT), RNA của virus được "đảo ngược" thành một DNA cụ thể thuận tiện hơn để phát hiện, đó là cDNA.
3. Khuếch đại và phát hiện cDNA
Trên thực tế, cho dù đó là tăm bông ngoáy họng, ngoáy mũi hay thậm chí lấy mẫu máu, hàm lượng vi rút trong mẫu tương đối thấp, ngay cả ở những bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng (tải lượng vi rút lớn); do các hạt vi rút quá nhỏ và thể tích lấy mẫu bị hạn chế, Số lượng vi rút có trong mẫu vẫn còn quá nhỏ để phát hiện axit nucleic.
Do đó, bằng cách sử dụng công nghệ PCR, các kiểm tra viên sẽ khuếch đại "mật khẩu" duy nhất của loại coronavirus mới trong mẫu đến điểm mà thiết bị có thể phát hiện ra, để đánh giá xem đó có phải là ca nhiễm dương tính hay không. Toàn bộ quá trình lấy vật liệu di truyền của vi-rút giống như câu cá. Cái móc sẽ xác định và tóm lấy nó, do đó vi-rút không có nơi nào để ẩn náu.
Nói một cách đơn giản, đó là khuếch đại số lượng cDNA, để cDNA được sao chép liên tục, để số lượng tăng theo cấp số nhân.
Quy trình PCR tiêu chuẩn được chia thành ba bước:
Biến tính: Việc sử dụng nhiệt độ cao để tách các sợi DNA kép. Liên kết hydro giữa các chuỗi kép DNA bị phá vỡ ở nhiệt độ cao (93 - 98 độ ).
Ủ: Sau khi các chuỗi kép DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để cho phép các đoạn mồi liên kết với DNA chuỗi đơn.
Kéo dài: DNA polymerase tổng hợp một chuỗi bổ sung dọc theo chuỗi DNA từ đoạn mồi được liên kết khi nhiệt độ hạ xuống. Khi quá trình kéo dài hoàn tất, một chu kỳ được hoàn thành và số lượng đoạn DNA tăng gấp đôi. Lặp lại ba bước này 25-35 lần và số lượng các đoạn DNA sẽ tăng theo cấp số nhân.
Mẫu sợi đôi PCR
Trong khi cDNA đang được khuếch đại, các đầu dò huỳnh quang trong bộ sẽ hoạt động đồng thời. Nó sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang và mỗi khi cDNA được khuếch đại, tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên một chút và máy dò PCR có thể ghi lại giá trị Ct của tín hiệu huỳnh quang tăng lên.
Giá trị Ct là một chỉ số quan trọng để đánh giá axit nucleic của virus là âm tính hay dương tính. DNA ban đầu càng ít thì càng cần nhiều chu kỳ PCR để đạt đến một ngưỡng nhất định và giá trị Ct càng cao. Ngược lại, DNA ban đầu càng nhiều thì giá trị Ct càng thấp. Lượng DNA ban đầu phản ánh lượng RNA của virus trong mẫu, từ đó phản ánh lượng virus trong mẫu. Do đó, nếu giá trị Ct không được phát hiện hoặc cao hơn một giá trị nhất định, thì bệnh nhân nghi ngờ được đánh giá là âm tính; nếu nó thấp hơn giá trị này thì bệnh nhân nghi ngờ được đánh giá là dương tính.
Trong quá trình phản ứng PCR, việc lựa chọn vật tư tiêu hao PCR cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả phát hiện axit nucleic.
