Công nghệ PCR - Có phải là ……? - Tin tức

Công nghệ PCR phải tổng hợp nhân tạo các đoạn mồi hợp lý và tách chiết DNA mẫu, sau đó thực hiện chu trình nhiệt tự động, cuối cùng là thực hiện phân tích và nhận dạng sản phẩm. Hiện tại, việc thiết kế và tổng hợp mồi chỉ có thể được thực hiện ở một số viện nghiên cứu, viện và phòng khám có thế mạnh về kỹ thuật. Ứng dụng chỉ cần mua bộ phát hiện PCR để bắt đầu công việc. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chu trình nhiệt tự động PCR. Đối với các mẫu DNA khác nhau, số lượng các thành phần khác nhau được thêm vào trong phản ứng PCR và các thông số chu kỳ nhiệt độ là không nhất quán.

Một số yếu tố ảnh hưởng chính hiện được giới thiệu như sau.

Một, các thông số chu kỳ nhiệt độ

Trong chu trình nhiệt tự động PCR, yếu tố quan trọng nhất là nhiệt độ biến tính và ủ. Như thể hiện trong ví dụ hoạt động, các điều kiện biến tính, ủ và kéo dài là: 94 ℃ 60 giây, 37 ℃ 60 giây, 72 ℃ 120 giây, tổng cộng 25 ～ 30 A chu kỳ, đoạn khuếch đại là 500bp. Ở đây, thời gian của mỗi bước cần được tính toán sau khi hỗn hợp phản ứng đạt đến nhiệt độ cần thiết. Trong bộ tuần hoàn nhiệt tự động, thời gian từ nhiệt độ ban đầu của hỗn hợp đến nhiệt độ yêu cầu mất 30-60 giây Độ dài của thời gian trễ này phụ thuộc vào một số yếu tố, bao gồm loại ống phản ứng, độ dày thành, thể tích hỗn hợp phản ứng, nhiệt. nguồn (nồi cách thủy hoặc khối gia nhiệt), và sự chênh lệch nhiệt độ giữa hai bước, cần được cung cấp đầy đủ khi thiết lập chu trình nhiệt. Hãy chú ý và xem xét, và phép đo thực tế phải được thực hiện trên từng thiết bị.

Một xem xét quan trọng khác về thời gian chu kỳ nhiệt là khoảng cách giữa hai mồi; khoảng cách càng xa thì càng mất nhiều thời gian để tổng hợp toàn bộ chiều dài của chuỗi mục tiêu. Thời gian phản ứng được đưa ra ở trên dựa trên độ dài tổng hợp tối ưu là 500bp Trình tự mục tiêu được vẽ lên. Đây là phần giới thiệu về việc lựa chọn các nhiệt độ khác nhau.

1. Nhiệt độ biến tính tiêu bản Nhiệt độ biến tính xác định nhiệt độ tại đó DNA sợi đôi tan chảy trong phản ứng PCR. Nếu không đạt đến nhiệt độ biến tính, không có khuôn mẫu DNA sợi đơn nào được tạo ra và PCR sẽ không bắt đầu. Nhiệt độ biến tính thấp có nghĩa là biến tính không hoàn toàn, DNA sợi kép Nó sẽ biến tính nhanh chóng, do đó làm giảm sản lượng. Nói chung là 90 ～ 95 ℃. Khi mẫu đạt đến nhiệt độ này, cần nhanh chóng làm nguội mẫu đến nhiệt độ ủ. Sự biến tính DNA chỉ diễn ra trong vài giây, và không cần thiết trong thời gian dài; ngược lại, bạn nên cố gắng hết sức ở nhiệt độ cao. Rút ngắn nó để duy trì hoạt động của Taq DNA polymerase. Nhiệt độ biến tính tối đa sau khi thêm Taq DNA polymerase không được vượt quá 95 ° C.

2. Nhiệt độ ủ mồi Nhiệt độ ủ xác định tính đặc hiệu và năng suất của PCR; nếu nhiệt độ cao thì tính đặc hiệu mạnh, nhưng nếu nhiệt độ quá cao thì mồi không thể kết hợp chắc chắn với khuôn, giảm hiệu quả khuếch đại DNA; nhiệt độ thấp thì năng suất cao, nhưng quá thấp có thể gây ra hiện tượng mồi và tiêu bản không phù hợp, Sản phẩm không đặc hiệu tăng lên. Nói chung, bắt đầu với điều kiện phản ứng là 37 ℃, thiết lập một loạt các phản ứng kiểm soát để xác định nhiệt độ ủ tối ưu cho một phản ứng cụ thể. Nó cũng có thể được suy ra dựa trên hàm lượng (G + C)% của mồi để nắm được bài kiểm tra Điểm bắt đầu của bài kiểm tra tổng quát, nhiệt độ ủ Ta (nhiệt độ ủ) thấp hơn nhiệt độ nóng chảy 5 ℃ TTm (nhiệt độ nóng chảy) của mồi khuếch đại, có thể được tính theo công thức:

Ta = Tm-5 ℃ = 4 (G {{2}} C) {{4}} 2 (A+T) -5 ℃

Trong số đó, A, T, G và C lần lượt thể hiện số lượng bazơ tương ứng. Ví dụ, đối với mồi gồm 20 bazơ, nếu hàm lượng (G + C)% là 50%, thì điểm bắt đầu của Ta có thể được đặt ở 55 ° C. Ở nồng độ mồi điển hình (chẳng hạn như 0,2μmol / L), phản ứng ủ có thể hoàn thành trong vài giây và không cần ủ lâu dài.

3. Việc lựa chọn nhiệt độ kéo dài mồi phụ thuộc vào nhiệt độ tối ưu của Taq DNA polymerase. Nói chung là 70 ～ 75 ℃, tốc độ tiêu chuẩn của các nucleotide xúc tác bằng enzyme ở 72 ℃ có thể đạt tới 35 ～ 100 nucleotide / giây. mỗi phút. Chiều dài 1kb có thể được mở rộng, và tốc độ của nó phụ thuộc vào thành phần của dung dịch đệm, giá trị pH, nồng độ muối và bản chất của khuôn mẫu DNA. Nếu đoạn khuếch đại ngắn hơn 150bp, bước mở rộng có thể được bỏ qua và nó trở thành chu trình nhiệt độ kép, vì Taq DNA Polymerase đủ để hoàn thành quá trình tổng hợp các chuỗi ngắn ở nhiệt độ ủ. Đối với các đoạn trình tự ngắn từ 100 đến 300 bp, hiệu quả là sử dụng chu trình nhiệt độ kép nhanh và đơn giản. Tại thời điểm này, nhiệt độ kéo dài của mồi giống như nhiệt độ ủ. Đối với các đoạn DNA trên 1kb, thời gian kéo dài có thể được kiểm soát trong vòng từ 1 đến 7 phút tùy theo chiều dài của đoạn. Đồng thời, gelatin hoặc thuốc thử BSA nên được thêm vào đệm PCR để giữ Taq DNA polymerase hoạt động và ổn định trong thời gian dài. Tình dục; 15% -20% glycerol giúp khuếch đại các đoạn DNA dài khoảng 2,5kb hoặc dài hơn.

4. Số chu kỳ của PCR thông thường nói chung là 25 đến 40 chu kỳ. Lỗi chung là số chu kỳ quá nhiều, nền không cụ thể, độ phức tạp tăng lên. Tất nhiên, số chu kỳ của phản ứng quá ít, và hiệu suất thấp. Vì vậy, cần phải đảm bảo rằng sản phẩm thu được. Theo tiền đề của tỷ lệ, số lượng chu kỳ nên được giảm thiểu.

Sau khi hoàn thành việc khuếch đại, mẫu được làm lạnh và bảo quản ở 4 ° C.

2. Thiết kế lớp lót Primer

Để khuếch đại DNA khuôn mẫu, trước tiên bạn phải thiết kế hai đoạn mồi oligonucleotide. Cái gọi là đoạn mồi thực chất là hai đoạn oligonucleotide bổ sung cho trình tự DNA đích cần được khuếch đại. Khoảng cách giữa hai mồi quyết định chiều dài của đoạn khuếch đại. , Các đầu 5' của hai mồi xác định vị trí của hai đầu 5' của sản phẩm khuếch đại. Có thể thấy, các đoạn mồi chính là yếu tố quyết định chiều dài, vị trí và kết quả của đoạn khuếch đại PCR, thiết kế đoạn mồi quan trọng hơn.

Điều kiện cần thiết để thiết kế đoạn mồi là phải biết trình tự DNA đích bổ sung cho đoạn mồi. Trình tự giữa hai mồi không nhất thiết phải rõ ràng. Hai trình tự đã biết nói chung là 15-20 bazơ, có thể được tổng hợp bằng bộ tổng hợp DNA. Ngoài ra, tương ứng với hai loại sơn lót bổ sung, các nguyên tắc thường được tuân theo trong thiết kế sơn lót bao gồm:

1. Chiều dài đoạn mồi được tính theo thống kê, và xác suất để một trình tự oligonucleotit có khoảng 17 bazơ có thể xuất hiện trong bộ gen người là một lần. Do đó, chiều dài đoạn mồi nói chung không nhỏ hơn 16 nucleotide, và cao nhất Không quá 30 nucleotide, và chiều dài tốt nhất là 20-24 nucleotide. Các oligonucleotide ngắn như vậy sẽ không tạo thành một lai ổn định ở nhiệt độ trùng hợp (vượt qua 72 ° C). Đôi khi nó có thể ở mức 5' Thêm các trình tự không bổ sung cho khuôn mẫu ở cuối, chẳng hạn như vị trí enzym giới hạn hoặc trình tự xúc tiến, để hoàn thành quá trình nhân bản gen và các nhu cầu đặc biệt khác; mồi 5' nhãn biotin cuối hoặc nhãn huỳnh quang có thể được sử dụng cho các mục đích khác nhau như phát hiện vi sinh vật.

Đôi khi mồi không' không hoạt động, không rõ nguyên nhân, bạn có thể di chuyển vị trí để giải quyết.

2. Thành phần của các loại mồi có hàm lượng (G + C)% phải đồng nhất và cố gắng tránh chứa cùng một loại polyme gốc. Nội dung% (G + C) trong hai đoạn mồi phải giống nhau nhất có thể, trong đoạn khuếch đại đã biết (G + C)% Nội dung phải gần với đoạn được khuếch đại, nói chung 40% đến 60% là tốt hơn.

3. Bên trong lớp sơn lót cần tránh hình thành các cấu trúc thứ cấp rõ ràng, đặc biệt là cấu trúc kẹp tóc. Ví dụ:

4. Không được có sự bổ sung giữa hai lớp sơn lót giữa các lớp sơn lót, đặc biệt là ở 3' cuối lớp sơn lót. Ngay cả khi không thể tránh được, bazơ bổ sung cuối 3' không được lớn hơn 2 bazơ, nếu không rất dễ tạo thành" primer dimer" Hoặc" Sơn lót" (Sơn lót). Cái gọi là primer dimer thực chất là một đoạn DNA sợi kép được hình thành bằng cách kéo dài đoạn mồi này trên chuỗi mồi khác dưới tác dụng của DNA polymerase. , Là một sản phẩm phụ phổ biến của PCR, và đôi khi thậm chí còn trở thành sản phẩm chính.

Ngoài ra, tránh trình tự tương đồng giữa hai mồi, đặc biệt là các đoạn oligonucleotit có nhiều hơn 6 bazơ giống nhau liên tiếp, nếu không hai mồi sẽ cạnh tranh với nhau về cùng một vị trí của tiêu bản; tương tự, đoạn mồi và ADN đích cần được khuếch đại Hoặc các trình tự khác của ADN mẫu không thể có trình tự tương đồng của nhiều hơn 6 bazơ. Nếu không, các mồi sẽ liên kết với các vị trí khác, làm giảm độ khuếch đại cụ thể và tăng độ khuếch đại không cụ thể.

5. Đoạn mồi 3' kết thúc bắt cặp DNA polymerase thêm một nucleotide vào đoạn 3' cuối đoạn mồi. Do đó, các yêu cầu bắt cặp của 5-6 base từ 3' cuối đoạn mồi và DNA đích phải chính xác và nghiêm ngặt để đảm bảo quá trình khuếch đại PCR hiệu quả. .

Việc thiết kế lớp sơn lót có hợp lý hay không có thể được xác minh bằng cách tìm kiếm trên máy tính bằng phần mềm PCRDESN và phần mềm PRIMER của Mỹ.

Các oligonucleotit được tổng hợp nhân tạo tốt nhất nên được tinh chế bằng phương pháp sắc ký (chromatography) hoặc PAGE để loại bỏ các tạp chất như các chuỗi ngắn chưa được tổng hợp hết chiều dài. Mồi đã tinh khiết được bảo quản trong dung dịch acetonitril 25% ở 4 ° C có thể ngăn chặn vi sinh vật Trong trường hợp bình thường, những mồi chưa sử dụng nên được bảo quản trong tủ lạnh ở -20 ° C. Mồi có thể được bảo quản ở dạng lỏng trong 6 tháng, và có thể được bảo quản trong 1 đến 2 năm sau khi đông khô.