1. Trong đĩa nuôi cấy, ngâm các phiến kính đã được leo lên bằng PBS ba lần, mỗi lần 3 phút.
2. Cố định các phiến kính với 4 phần trăm paraformaldehyde trong 15 phút và ngâm các phiến kính trong PBS 3 lần, mỗi lần 3 phút.
3. Cho thấm bằng 0.5% Triton X-100 (được điều chế trong PBS) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng (đối với kháng nguyên biểu hiện trên màng tế bào, bước này được bỏ qua).
4. Chặn huyết thanh: nhúng các phiến kính vào PBS 3 lần, mỗi lần 3 phút, làm khô PBS bằng giấy thấm, thêm huyết thanh dê bình thường (với điều kiện nguồn kháng thể thứ cấp là dê) trên các phiến kính và chặn ở nhiệt độ phòng cho 30 phút.
5. Thêm kháng thể sơ cấp: Dùng giấy thấm thấm dung dịch chặn, không rửa, cho một lượng vừa đủ kháng thể sơ cấp đã pha loãng vào mỗi lam kính rồi cho vào hộp ướt, ủ 4 độ C qua đêm.
6. Thêm kháng thể thứ cấp huỳnh quang: nhúng các phiến kính vào PBST 3 lần, mỗi lần 3 phút, dùng giấy thấm hút hết chất lỏng dư thừa trên các phiến kính, thêm từng giọt kháng thể thứ cấp huỳnh quang đã pha loãng, ủ ở 20-37 độ trong 1 giờ trong hộp ướt, ngâm trong PBST Slice 3 lần, mỗi lần 3 phút.
Lưu ý: Từ việc bổ sung kháng thể thứ cấp huỳnh quang, tất cả các bước tiếp theo phải được thực hiện ở nơi tối càng nhiều càng tốt.
7. Chặn huyết thanh: thấm chất lỏng bằng giấy thấm, nhỏ huyết thanh dê bình thường lên phiến kính (với điều kiện nguồn kháng thể thứ cấp là dê) và chặn ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
8. Thêm kháng thể sơ cấp: Thấm dung dịch chặn bằng giấy thấm, không rửa, sau đó thêm từng giọt kháng thể sơ cấp đã pha loãng, ủ qua đêm trong hộp ẩm 4 độ trong bóng tối sau khi thêm kháng thể sơ cấp. (Lưu ý: loài của kháng thể sơ cấp thứ hai khác với loài của kháng thể sơ cấp thứ nhất, chẳng hạn như chuột và thỏ)
9. Thêm kháng thể thứ cấp huỳnh quang: nhúng các phiến kính vào PBST 3 lần, mỗi lần 3 phút, dùng giấy thấm thấm chất lỏng thừa trên các phiến kính, thêm từng giọt kháng thể thứ cấp huỳnh quang đã pha loãng, ủ ở 20-37 độ trong 1 giờ trong hộp ướt, ngâm trong PBST Slice 3 lần, mỗi lần 3 phút. (Lưu ý: Nếu huỳnh quang màu đỏ được chọn để phát hiện kháng thể thứ nhất thì kháng thể thứ hai phải chọn các màu huỳnh quang khác)
10. Hạt nhân nhuộm màu: DAPI được thêm từng giọt và ủ trong bóng tối trong 5 phút, mẫu vật được nhuộm màu và DAPI dư thừa được rửa sạch bằng PBST 5 phút × 4 lần.
11. Làm khô chất lỏng trên phiến kính bằng giấy thấm, bịt kín phiến kính bằng chất lỏng gắn kết có chứa chất khử huỳnh quang, quan sát và thu thập hình ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang.